Proizvodnja in biokemijska karakterizacija lakaze NRC 620 iz ostrigarskih gob ter ocena njene učinkovitosti pri bistrenju jabolčnega soka.

Po 25 dneh statične inkubacije pri 28 °C je lakaza iz *Pleurotus ostreatus* NRC620 pokazala najvišjo aktivnost v gojišču za gojenje gliv. Optimalni vrednosti pH in temperature za ta encim sta bili 3,0 oziroma 70 °C. Po 2 urah inkubacije pri 40 °C in 50 °C se je aktivnost encima ohranila pri 68,33 % oziroma 59,61 %. Po 2 urah inkubacije v citratno-fosfatnem pufru (pH 7,0) se je aktivnost encima ohranila pri 100 %. Dodatek 10 mM MgSO₄ in CuSO₄ je povečal aktivnost encima za približno 21 % oziroma 35 %, medtem ko so NaCl, MnCl₂, KCl in CaCl₂ aktivnost encima zavirali. Pri uporabi ABTS kot substrata so bili kinetični parametri (Km in Vmax) lakaze *Pleurotus ostreatus* NRC 620 1,99 mM oziroma 16.217 μmol min−1 L−1. Encimska obdelava vzorcev jabolčnega soka je znatno znižala tako pH kot viskoznost, to zmanjšanje pa je bilo povezano s podaljšanjem časa skladiščenja. Obdelava z lakazo je povzročila rahlo zmanjšanje skupne vsebnosti fenolnih spojin v jabolčnem soku, vendar ni bilo opaženo zmanjšanje antioksidativne aktivnosti.
V zadnjih letih se raziskovalci osredotočajo na uporabo zelene biotehnologije v živilski industriji. Lakaza je eden najbolj uporabnih encimov v živilski industriji, ki se uporablja na področjih, kot so predelava sokov, peka, stabilizacija vina in izboljšanje organoleptičnih lastnosti živilskih izdelkov.¹Številne višje rastline in mikroorganizmi izločajo lakazo,²in glive, kot so deuteromicete, askomicete in bazidiomicete, lahko prav tako proizvajajo lakazo.³Lakaza (EC 1.10.3.2) je modra oksidaza, ki reducira molekularni kisik v vodo z uporabo sistema, sestavljenega iz treh različnih atomov bakra, s čimer oksidira različne fenolne spojine in aromatske amine. Med proizvodnjo sadnih in zelenjavnih sokov sta encimsko in neencimsko porjavitev ključnega pomena.⁴Ker te snovi negativno vplivajo na barvo, okus in aromo soka, jih je treba odstraniti.⁵
Od vsega sadja so jabolka najbolj porabljena po vsem svetu in v Evropski uniji. Leta 2019 je bila proizvodnja jabolk na tretjem mestu na svetu, saj je presegla 87 milijonov ton.⁶Jabolka vsebujejo številne fenolne spojine, vključno s flavonoidi in fenolnimi kislinami, kot sta kofeinska kislina in klorogenska kislina.⁷Ker se jabolčni sok običajno uživa v bistri obliki, se med postopkom filtracije izgubi približno 50 % do 90 % fenolnih komponent.⁸Danes potrošniki raje izbirajo minimalno predelane izdelke, kot je moten jabolčni sok z visoko vsebnostjo polifenolov. Vendar pa je ta vrsta jabolčnega soka zaradi visoke vsebnosti fenolnih spojin še posebej dovzetna za razbarvanje in potemnenje.⁹Za zmanjšanje ali preprečevanje potemnitve jabolčnega soka se uporabljajo različne tehnologije, vključno s toplotnimi metodami, kot je pasterizacija pri 60–90 °C.¹⁰Vendar pa po raziskavi Sauceda-Gálveza¹¹, termična obdelava lahko uniči hlapne kemikalije in vpliva na organoleptične lastnosti jabolčnega soka. Alternative metodam termične obdelave vključujejo superkritični ogljikov dioksid, ultravijolično sevanje, ultrazvok, visok hidrostatični tlak ali homogenizacijo pod visokim tlakom.¹²Učinkovitost teh tehnologij in izkoristek primernih sadnih sokov sta odvisna od uporabljenih parametrov in značilnosti izdelka. Njihovo široko uporabo omejujejo visoki stroški, škodljivi učinki na kakovost nekaterih živilskih izdelkov ali neustrezna inaktivacija encimov.^13,14
Lakaza se lahko uporablja za stabilizacijo in bistrenje sadnega soka.¹⁵Gökmen in drugi.¹⁶Priporočajo uporabo lakase za bistrenje sadnega soka, ker učinkovito odstranjuje fenolne spojine tako, da jih pretvori v polimere ali oligomere, ki jih zlahka odstrani katera koli ultrafiltracijska membrana, kar omogoča, da jabolčni sok ohrani stabilno barvo in bistrost do šest tednov pri 50 °C. Prečiščena lakasa *Trichoderma* je bila imobilizirana na aluminijevih kroglicah in uporabljena za selektivno odstranjevanje spojin neprijetnega okusa, ki jih povzroča mikrobna kontaminacija jabolčnega soka.¹⁷
Približno 80–90 % hlapnih sestavin jabolčnega soka so estri in aldehidi, ki soku dajejo edinstveno aromo.¹⁸Lakaza iz *Trametes versicolor* je bila imobilizirana na poceni nosilcu iz naravnih vlaken iz mladih kokosovih lupin za bistrenje jabolčnega soka.¹⁹Prejšnje študije so raziskovale stabilizacijo jabolčnega soka (barva in motnost) z uporabo metod brez encimov ali imobilizacije ali v kombinaciji z ultrafiltracijo.^5,19Vendar pa vpliv glivičnih lakaz na fizikalno-kemijske lastnosti jabolčnega soka med shranjevanjem ostaja nejasen. Zato je bil cilj te študije eksperimentalno raziskati spremembe fizikalno-kemijskih lastnosti, vsebnosti fenolnih spojin in antioksidativne aktivnosti jabolčnega soka po obdelavi z glivičnimi lakazami in dvotedenskem shranjevanju v hladilniku. Lakaze imajo sposobnost oksidacije fenolnih spojin, zaradi česar so obetavne za uporabo v različnih industrijskih procesih, vključno z bistrenjem soka. Ta študija je preučevala lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620, s poudarkom na idealnih pogojih za njihovo aktivnost in učinkovitost pri bistrenju soka. Čeprav so raziskave ostrigarjev (P. ostreatus NRC 620) še vedno omejene, so prejšnje študije preučevale encime iz različnih glivičnih virov, kot sta Trametes versicolor in Ganoderma lucidum. Cilj te študije je bil oceniti potencialno uporabo tega encima v živilski industriji in poudariti njegove edinstvene lastnosti, zlasti njegov idealen pH in temperaturo.
2,2′-azooksibis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina) (ABTS) je bil kupljen pri podjetju Sigma-Aldrich (Kanada). Vsi drugi reagenti so bili analitske kakovosti.
Zbirni center za mikrobne kulture Nacionalnega raziskovalnega centra je pridobil znani sev ostrigarja NRC620. Po subkultivaciji je bil ta sev shranjen na poševnih ploščah s krompirjevim dekstroznim agarjem pri 4 °C. Metoda priprave inokuluma je bila naslednja: 10 dni star, popolnoma razvit micelij je bil inokuliran na plošče s krompirjevim dekstroznim agarjem in inkubiran pri 28 °C. Po 10 dneh so bili trije micelijski bloki s premerom 12 mm odstranjeni iz agarja s sterilnim kovinskim luknjačem in postavljeni v 250-mililitrske erlenmajerice z vatiranimi zamaški, ki so vsebovale 50 ml steriliziranega gojišča (pH 5,0, kot so prej opisali Othman in sod.).²⁰). Kulture so bile inkubirane pri 28 °C 18 dni. Nato so bile kulture filtrirane skozi filtrirni papir Whatman št. 1, nastali supernatant pa je služil kot vir encimov.
Aktivnost lakaze je bila določena z uporabo ABTS kot substrata. Reakcijska zmes (2 mL) je vsebovala 500 μL 0,3 mM ABTS (raztopljenega v 0,1 M natrijevem citratnem pufru, pH 4,5) in potrebno količino vzorca encima, razredčenega z destilirano vodo.^21,22Glede na to, da lahko lakaza oksidira ABTS pri sobni temperaturi (28 °C ± 2), je bila oksidacija ABTS določena z merjenjem povečanja absorbance pri 420 nm (ε₄₂₀= 36.000 cm^-1 M ^-1) z uporabo UV spektrofotometra Agilent Carry-100. Za oksidacijo 1 μmol ABTS na minuto je bila potrebna ena enota aktivnosti lakaze. Koncentracijo beljakovin smo določili po Bradfordovi metodi z uporabo govejega serumskega albumina kot notranje kontrole.^23,24
Po pridobitvi encima iz seva ostrigarja NRC 620 je bila njegova aktivnost merjena v različnih intervalih gojenja 25 dni v statičnih pogojih pri 28 °C.
Za preučevanje vpliva temperature na aktivnost lakaze so bili poskusi izvedeni v temperaturnem območju od 20 do 90 °C. Pred dodajanjem encima in začetkom reakcije sta bila pufer (0,1 M natrijev citrat, pH 4,5) in substrat (ABTS) zmešana in inkubirana 5 minut pri različnih temperaturah. Termična stabilnost encima je bila ocenjena z inkubacijo v 0,05 M natrijevem fosfatnem pufru (pH 7,0) pri 40, 50, 60 in 70 °C 2 uri. Preostala aktivnost je bila nato ocenjena z uporabo substrata ABTS.
Vpliv pH na aktivnost lakaze je bil ocenjen z uporabo ABTS kot substrata v 0,1 M citratno-fosfatnih pufrih s pH območjem od 2,5 do 7,0. Raztopino encima smo inkubirali pri 40 °C dve uri v 0,1 M citratnem in Tris pufrih (pH 3, 4, 6 in 7) za oceno stabilnosti pH. Preostala aktivnost z ABTS kot substratom je bila izračunana po inkubaciji.
Lakazo smo 10 minut inkubirali v natrijevem fosfatnem pufru (0,05 M, pH 7,0), ki je vseboval različne kovinske ione (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ in Mn2+) v koncentracijah 2,5 mM oziroma 10 mM. Nato smo dodali substrat (ABTS) za začetek reakcije in ocenili relativno aktivnost.
Oksidacijo ABTS z lakazo pri različnih koncentracijah (0,025–3 mM) smo merili pri pH 4,5 za določitev kinetičnih parametrov (Vmax in Km).^konstanteMichaelis-Mentenove enačbe so bile izračunane z uporabo Lineweaver-Burkovega diagrama, ki prikazuje recipročno vrednost hitrosti reakcije kot funkcijo koncentracije substrata. Kinetične konstante so bile izračunane iz Lineweaver-Burkovega diagrama z uporabo programske opreme GraphPad Prism različice 6.01.
Po temeljitem pranju jabolk z vodo iz pipe so jih prerezali na pol in iz njih iztisnili sok s popolnoma avtomatskim sokovnikom za jabolka Braun MP80 (izdelanega v Nemčiji). Sok so filtrirali skozi štiri plasti gaze. Kontrolni skupini niso dodali encimov, sveže pripravljenemu jabolčnemu soku pa so dodali 2,0 % lakaze (najučinkovitejša testirana koncentracija), ki so ga nato dva tedna shranjevali pri 4 °C.
Titrabilna kislost (TA) in pH sta bila določena po metodi Boultona in ...^al.27PH vsakega vzorca smo izmerili z digitalnim pH-metrom (pH-meter JENWAY 3510). Titrabilna kislost (TA) smo izračunali na podlagi jabolčne kisline po naslednji formuli.
Kjer sta V in C volumen (ml) oziroma koncentracija (0,1 mol/l) raztopine natrijevega hidroksida, uporabljene pri titraciji. K je pretvorbeni koeficient jabolčne kisline, enak 0,067, W pa je masa (g) jabolčnega soka.
Skupne topne trdne snovi (^TDSVsebnost ) v vseh vzorcih soka je bila določena z žepnim refraktometrom PAL-1 (ATAGO, Tokio, Japonska). Po vsaki meritvi je bila optična leča sprana z deionizirano vodo in vsak vzorec jabolčnega soka je bil testiran trikrat. Vrednost za vsak vzorec je bila izračunana s povprečjem treh meritev. Povprečje ± standardni odklon za vsak vzorec jabolčnega soka je bil prav tako izračunan s povprečjem teh rezultatov.
Viskoelastičnost vzorcev jabolčnega soka je bila ocenjena z rotacijskim viskozimetrom (RV, Rheotest 2, Nemčija). Vzorec je bil nameščen v valj "S2" viskozimetra. Navidezna viskoznost je bila predstavljena z naklonom krivulje strižne napetosti glede na strižno hitrost, ki je bila izračunana iz strižne napetosti in ustreznih krivulj pri različnih strižnih hitrostih (od 1,00 do 437,4 s⁻¹). Formula za izračun navidezne viskoznosti je naslednja:
Kjer je η navidezna viskoznost (cP), τ strižna napetost (dyn/cm²), γ strižna hitrost (s⁻¹) in (τ) se izračuna z uporabo vrednosti navora (α) in valja (Z) po naslednji formuli: τ = Z . α.
Indeks porjavitve je bil določen po metodi Meidav ​​et al.^al.2910 ml vzorec soka smo centrifugirali pri 2750 xg 10 minut. 5 ml supernatanta soka smo zmešali s 5 ml 95 % etanola. Absorbanco mešanice smo izmerili pri 420 nm z uporabo UV spektrofotometra Shimadzu (UV-1601 PC).
Skupna vsebnost fenolov (TPC) je bila določena kolorimetrično z uporabo Folin-Ciocalteujevega reagenta, kot so opisali Boulton in sod.^[27]]. Standardna krivulja galne kisline je bila konstruirana za koncentracije od 0 do 500 mg/L (^r²= 0,997). Rezultati so izraženi kot ekvivalenti galne kisline (mg GAE/ml).
K 25 μL jabolčnega soka dodajte 125 μL destilirane vode in 2850 μL raztopine FRAP ter mešanico pustite v temi³⁰min. Nato izmerite absorbanco pri 593 nm z uporabo UV spektrofotometra Shimadzu (UV-1601 PC). Reagent FRAP smo pripravili z mešanjem 300 mM acetatnega pufra (pH 3,6), 20 mM železovega(III) klorida in 10 mM 2,4,6-tris(2-piridil)triazina (TPTZ) (raztopljenega v 40 mM HCl) v razmerju 10:1:1. Standardna krivulja je bila ustvarjena z uporabo Troloxa kot standarda (^R²= 0,999), rezultati pa so izraženi kot μM troloksa/ml.
Antioksidativno aktivnost obdelanih in neobdelanih sokov je bila določena z metodo DPPH za oceno njihove sposobnosti lovljenja prostih radikalov DPPH.³¹Deset mikrolitrov soka smo zmešali z 1 ml raztopine DPPH (100 μM) v metanolu. Po 30-minutni reakciji v temi smo absorbanco mešanice izmerili pri 517 nm z uporabo UV-spektrofotometra Shimadzu (UV-1601 PC). Rezultati so bili izraženi kot ekvivalenti troloksa (μM troloksa/ml) na podlagi umeritvene krivulje (_^R2= 0,990).
Pridobljeni podatki so pokazali, da je bila največja proizvodnja lakaze v ostrigarjih NRC 620 opažena do konca 18. dneva fermentacije, pri čemer je bila dosežena aktivnost 1302 U/L. To je služilo kot osnova za določitev optimalnega časa gojenja za proizvodnjo lakaze (slika 1). Čeprav se je proizvodnja encimov povečevala z daljšim časom gojenja, stopnja povečanja ni bila neposredno sorazmerna s časom gojenja; po 21 dneh se je aktivnost encimov povečala le za 90 U/L (na 1390 U/L). Zato je bil za optimalen čas gojenja na koncu izbran 18 dni, da bi se uravnotežil pridelek produkta z ekonomskimi koristmi daljšega časa gojenja.
Vpliv časa gojenja na donos lakaze pri Pleurotus ostreatus NRC 620. Trije (12 mm) micelijski bloki gliv so bili inokulirani v 50 ml sterilnega gojišča in nato gojeni pri 28 °C različno dolgo.
V skladu z drugimi študijami naši rezultati kažejo, da je idealno obdobje gojenja za doseganje največjega izločanja lakaze pri glivah verjetno med 7 in 36 dnevi.³²Po mnenju Ezikeja in sodelavcev.³³, *Trametes polyzona* WRF03 je do konca devetega dne fermentacije proizvedel največjo količino lakaze, s specifično aktivnostjo 1637 U/mg beljakovin. Poleg tega so Othman in sod.³⁴Ugotovili so, da *Trichoderma harzianum* S7113 izloča veliko količino lakaze peti dan gojenja. Stopnja proizvodnje lakaze je dosegla vrhunec štirinajsti dan in se nato postopoma zmanjševala.³⁴Čeprav se izločanje encimov lahko pojavi tudi med glavno rastno fazo, običajno doseže vrhunec v vmesni fazi in ga sproži poraba vira ogljika ali dušika.^34,35
Čeprav je lakaza iz Pleurotus ostreatus NRC 620 pokazala visoko aktivnost v širokem temperaturnem območju od 50 °C do 80 °C, blizu vrhunca aktivnosti (69–98 %), je bila njena največja aktivnost opažena pri 70 °C (slika 2a). Zunaj tega temperaturnega območja se je aktivnost encima zmanjšala pri približno 70 °C. Ti rezultati kažejo, da je encim aktiven pri visokih temperaturah, verjetno zato, ker visoka temperatura poveča kinetično energijo reakcije.
Vpliv reakcijske temperature (a) in pH (b) na aktivnost lakaze v *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperature v območju od 20 do 90 °C so bile dosežene s predhodno inkubacijo mešanice pri različnih temperaturah 5 minut pred dodajanjem encima in začetkom reakcije. Vpliv pH na aktivnost lakaze je bil ocenjen z uporabo ABTS kot substrata v raztopinah, ki so vsebovale 0,1 M citratno-fosfatnega pufra v območju pH od 2,5 do 7,0.
Po mnenju Ezikeja in drugih^al.33Optimalna temperatura za lakazo *Trametes polyzona* WRF03 je 55 °C, kar je enako kot za *Ganoderma lucidum*.^laccase36in podobno optimalni temperaturi (50 °C) za *Trametes polyzona* KU-RNW02737^lakaza . ^Baldrian38ugotavlja, da je, tako kot za druge encimske sisteme, ki razgrajujejo lignin, idealno temperaturno območje za lakazo med 50 in 70 °C.
Rezultati so pokazali, da je encim pokazal najvišjo aktivnost pri pH 3,0, saj je dosegel 94 % aktivnosti pri pH 3,5. Vendar je ostal aktiven v širokem območju pH od 2,5 do 7,0 (slika 2b). Poleg tega je pokazal večjo aktivnost v kislih pogojih v primerjavi z nevtralnimi ali alkalnimi pogoji. Njegova aktivnost je ostala vsaj 77 % v območju pH od 2,5 do 4,5, vendar je dosegla le približno 38 % pri pH 7,0. Optimalni pH za lakazo iz *Trametes polyzona* WRF03 je bil 4,533, kar je enako pH-ju za lakaze iz *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 in *Trametes hirsuta* 41. Vendar pa je po študiji Chairina in sodelavcev ...⁴², optimalni pH za lakazo iz *Polymorpha f. sp.* WR710-1 je 2,2, medtem ko je optimalni pH za lakazo iz *Polymorpha f. sp.* IBL-04 5,043. Vezava hidroksidnih anionov (zaviralec lakaze) na bakrove atome lakaze T2/T3 je lahko razlog za zmanjšano aktivnost lakaze v nevtralnih ali alkalnih pogojih pH. To lahko moti notranji prenos elektronov iz centra T1 v center T2/T3, s čimer^omejevanjeencimska aktivnost23,44
Z inkubacijo encima pri različnih temperaturah so ugotovili, da tako čas inkubacije kot temperatura vplivata na stabilnost encima. Lakaza iz *Trametes polyzona* NRC 620 je pokazala večjo stabilnost pri 40 ℃ in 50 ℃, saj je po 120 minutah ohranila 68,33 % oziroma 59,61 % svoje začetne aktivnosti (slika 3a). Nasprotno pa je lakaza iz *Trametes polyzona* WRF03 pod enakimi pogoji (40 ℃ in 50 ℃, 120 minut) ohranila 64,38 % oziroma 42,92 % svoje aktivnosti.³³Nasprotno pa je povečanje časa inkubacije in temperature zmanjšalo stabilnost lakaze *Trametes polyzona* NRC 620; po inkubaciji pri 60 ℃ in 70 ℃ 60 minut se je njena aktivnost zmanjšala na 39,24 % oziroma 1,72 % (slika 3a). V skladu z eksperimentalnimi rezultati je lakaza iz *Trametes polyzona* WRF03 pokazala večjo stabilnost pri 40 in 50 ℃ med celotnim postopkom toplotne obdelave.³³Podobno Lueangjaroenkit in drugi^al.37in predsednik in drugi^al.42poročali o stabilnosti lakaz iz Trametes polyzona KURNW027 in Trametes polyzona WR710-1 pri 50 °C 1 uro. Kot uporaben biokatalizator, ki se uporablja na različnih biotehnoloških področjih, bi morala imeti lakaza dobro stabilnost in delovanje v širokem temperaturnem območju.
Termostatska stabilnost (a) in pH stabilnost (b) lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Termostatska stabilnost je bila ocenjena z inkubacijo encimske raztopine v 0,05 M natrijevem fosfatnem pufru (pH 7,0) pri 40, 50, 60 in 70 °C 2 uri. pH stabilnost je bila ocenjena z inkubacijo encimske raztopine v 0,1 M citratnem pufru in Tris pufru (pH 3, 4, 6 in 7) pri 40 °C 2 uri. Preostala aktivnost je bila izračunana z uporabo ABTS kot substrata po inkubaciji.
Za določitev optimalnih pogojev za uporabo in shranjevanje encima smo raziskali vpliv pH na stabilnost lakaze. Izpostavljenost različnim vrednostim pH je pomembno vplivala na stabilnost proteinske strukture, s čimer je vplivala na stabilnost in aktivnost encimske molekule. Rezultati so pokazali, da je bil encim manj stabilen v kislih pogojih, medtem ko je pokazal boljšo stabilnost pri višjih vrednostih pH (nevtralno in alkalno območje). Pri vrednostih pH 7,0, 6,0, 4,0 in 3,0 so bile stopnje zadrževanja encima po 120 minutah približno 100 %, 62,54 %, 52,39 % oziroma 11,14 % (slika 3b). Lakaza *Strombus multisus* WRF03 je pokazala večjo stabilnost pri nevtralnih vrednostih pH (5,5–6,5) in nižjo stabilnost pri kislih vrednostih pH (pod 4,0). Po 120 minutah pri pH vrednostih 5,5, 6,0 in 6,5 je bila stopnja zadrževanja encimov približno 82 %, 100 % oziroma 93 %.³³Khairin in drugi.⁴²ugotovili, da je bila lakaza iz Trametes polyzona WR710-1 stabilna v območju pH od 6,0 ​​do 7,0, medtem ko so Sayed et al.⁴⁵pokazala, da je lakaza stabilnejša v nevtralnih pogojih pH. Vendar pa je lakaza iz Cerrena unicolor pokazala stabilnost tudi v alkalnih pogojih (pH 9,0).⁴⁶Preučene lakaze so pokazale visoko stabilnost v širokem območju pH. To je lahko pomembna lastnost za industrijsko uporabo.
Ker imajo nekateri kovinski ioni tako stimulativne kot zaviralne učinke na encimsko aktivnost, je treba njihove učinke na encimsko aktivnost upoštevati pri industrijskih aplikacijah. To je ključnega pomena, ker so kovinski ioni pogosti onesnaževalci okolja, ki lahko vplivajo na stabilnost in sintezo zunajceličnih encimov.⁴⁷Za raziskavo učinkov več kovinskih ionov na lakazo iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620 smo izvedli ustrezne poskuse. Kot je prikazano na sliki 4, je povečanje koncentracije kovinskih ionov z 2,5 mM na 10 mM, odvisno od vrste uporabljene kovine, negativno vplivalo na delovanje encima. Na primer,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺in^Cu²⁺lahko spodbudi in aktivira encimsko aktivnost, medtem ko^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺in^K⁺lahko zavira aktivnost encima. Pri koncentraciji 10 mM sta bila iona Cu²⁺ in Mg²⁺ najmočnejši aktivatorji aktivnosti lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620, saj sta dosegla stopnjo aktivacije približno 34 % oziroma 20 %. Vendar pa sta bila pri koncentraciji 10 mM iona Ca²⁺ najmočnejši zaviralec lakaze, saj sta zmanjšala aktivnost encima za približno 60 %.
Vpliv kovinskih ionov na aktivnost lakaze Pleurotus ostreatus NRC 620. Lakaza je bila 10 minut inkubirana v natrijevem fosfatnem pufru (0,05 M, pH 7,0), ki je vseboval različne kovinske ione v koncentracijah 2,5 mM in 10 mM. Reakcijo je bilo nato sproženo z dodatkom substrata (ABTS), nakar je bila izmerjena relativna aktivnost.
Naši rezultati so skladni z rezultati drugih avtorjev, ki so ugotovili, da Mg²⁺ in Cu²⁺ povečata aktivnost *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño in sod.⁴⁸ so ugotovili, da bakrovi ioni (Cu²⁺) do neke mere stimulirajo lakazo iz *Xylaria* sp. Poleg tega so Foroutanfar in sod.⁴⁹ ter Si in sod.⁵⁰ izvedli podobne študije na lakazah iz *Paraconiothyrium variabile* oziroma *Trametes pubescens*. Vezavno mesto bakra tipa II (T2) tega encima je lahko pri dani koncentraciji nasičeno s Cu²⁺, kar lahko pojasni stimulacijo aktivnosti lakaze pri višjih koncentracijah Cu²⁺³⁹. Ker so lakaze gliv bele gnilobe oksidaze, ki vsebujejo več atomov bakra, so učinki bakrovih ionov na aktivnost lakaz raznoliki in segajo od stimulativnih in zaviralnih do nevtralnih.⁵¹ Nasprotno pa Zhou et al.^[52]poročal, da^Cu²⁺zaviral aktivnost lakaze tajvanskega podzemnega termita (Odontotermes formosanus). Vendar pa so lakaze Cerena sp. HYB07^[53]in Clitocybe maxima^[54]niso bili prizadeti zaradi bakrovih ionov.
Specifičnost substrata je bila predstavljena z njegovimi kinetičnimi parametri (Km in Vmax); močnejša kot je vezavna afiniteta substrata na encim, nižja je vrednost Km in višja je specifičnost substrata.^3,21,55Kinetični parametri (Km in Vmax) lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620 so bili določeni z uporabo programske opreme GraphPad Prism 6.0 z risanjem Lineweaver-Burkovega diagrama (slika 5). Pri uporabi ABTS kot substrata so bili rezultati 1,99 mM in 16217 μmol.^{min⁻¹ L⁻¹,}Elsayed et al.²¹poročali so, da sta bili vrednosti Km za oksidacijo ABTS 0,1 mM oziroma 0,064 mM, kar kaže na visoko afiniteto izoencimov Lac A in Lac B za ABTS. Poleg tega sta bili vrednosti Vmax 0,182 μmol^min⁻¹in 0,603 μmol^min⁻¹, oziroma. Dobljena vrednost Km je bila nižja od vrednosti Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); poleg tega je bila tudi njihova vrednost Vmax (1429 mmol min⁻¹)^nižjepri uporabi ABTS kot substrata.33 Podobno so bile vrednosti Km ​​koncentracij lakaze Lentinus squarrosulus MR13 in Trametes sp. AH28-2 0,0714 mM oziroma 0,025 mM, vrednosti Vmax pa 0,0091 mM min−1 in 0,67 mM min−1 mg−1 (glede na ABTS).^{, oziroma .56,57}
Raziskali smo vpliv koncentracije ABTS na aktivnost lakaze iz *Pleurotus ostreatus* NRC 620 in narisali Lineweaver-Burkov diagram recipročne vrednosti začetne hitrosti reakcije glede na koncentracijo ABTS. Oksidacijsko reakcijo ABTS z različnimi koncentracijami (0,025–3,0 mM) lakaze smo izmerili pri pH 4,5, da bi določili kinetične parametre (Vmax in Km). Michaelis-Mentenove kinetične konstante smo izračunali z uporabo Lineweaver-Burkovega diagrama recipročne vrednosti hitrosti reakcije glede na koncentracijo substrata. Kinetične konstante smo izračunali iz Lineweaver-Burkovega diagrama z uporabo programske opreme GraphPad Prism 6.01.
Tradicionalni encimi za bistrenje, kot so pektinaze, hidrolizirajo pektinske snovi, s čimer zmanjšajo viskoznost in motnost. Učinkovito razgrajujejo strukturne polisaharide in se pogosto uporabljajo v kombinaciji z drugimi encimi, kot so celulaze in hemicelulaze, za izboljšanje izkoristka in bistrosti. Vendar pektinaze ne ciljajo posebej na fenolne spojine, ki so glavni vzrok za motnost in oksidativno porjavitev, zlasti v sokovih, kot sta jabolčni in grozdni sok.⁵⁸V nasprotju s tem lakaze katalizirajo oksidacijo fenolnih spojin in jih polimerizirajo v večje, netopne molekule, ki jih je mogoče odstraniti s sedimentacijo ali filtracijo. Ta mehanizem ne le izboljša bistrost, temveč tudi podaljša rok uporabnosti soka, saj zmanjša verjetnost oksidativnega porjavitve, ki jo povzročajo fenolne spojine. Poleg tega se lahko postopki bistrenja na osnovi lakaz izvajajo v blagih pogojih predelave (pH 3,5–5,5, temperatura 25–40 °C), zaradi česar so primerni za občutljive sokove, ne da bi pri tem ogrozili njihove hranilne ali organoleptične lastnosti.⁵⁹Študije so pokazale, da lahko obdelava s pektinazo zbistri sok v 1–2 urah, medtem ko obdelava z lakazo običajno zahteva daljši reakcijski čas (3–6 ur) za popolno redukcijo fenolnih spojin. Vendar pa je ta postopek mogoče optimizirati z imobilizacijo encima ali z združevanjem lakaze z mehanskimi metodami čiščenja.⁶⁰V tej študiji je encimsko profiliranje surovega ekstrakta pokazalo znatno aktivnost lakaze in α-amilaze, medtem ko sta bili aktivnosti pektinaze in ksilanaze izjemno nizki, celulazna aktivnost pa ni bila zaznana. Zato je bilo zmanjšanje motnosti in vsebnosti fenolov predvsem posledica delovanja lakaze, medtem ko bi lahko bila sprememba viskoznosti delno posledica delovanja amilaze.
Tabela 1 prikazuje fizikalno-kemijske parametre sveže stisnjenega jabolčnega soka in vzorcev, obdelanih z lakazo. Rezultati so pokazali, da je bil izkoristek sveže stisnjenega jabolčnega soka (71,59 %) nižji kot pri vzorcih, obdelanih z lakazo (87,34 %). Ti rezultati so skladni z ugotovitvami Pilnika in Orangea.⁶¹, ki je navedel, da lahko uporaba encimov pri predelavi sadja poveča izkoristek soka, izboljša filtracijo in pridobi visokokakovosten, bister sok za koncentracijo. Povečanje izkoristka soka je predvsem posledica povečanja vsebnosti topnih sladkorjev v soku. Med encimsko hidrolizo sadja se mezoglej in pektin v celičnih stenah izdelka uničita in pretvorita v topne snovi, kot so nevtralni sladkorji in kisline.^62.Vrednost pH encimsko obdelanega jabolčnega soka je bila bistveno nižja kot pri kontrolni skupini (P < 0,05), vrednost pH obeh skupin pa se je med shranjevanjem znatno povečala (tabela 1). Ti rezultati so skladni z rezultati Marka in sodelavcev.⁶³, ki je ugotovil, da se je pH soka indijskih oreščkov po shranjevanju po toplotni obdelavi zmanjšal. Razgradnja pektina in tvorba galakturonske kisline po encimski obdelavi sta lahko odgovorni za zvišanje pH med shranjevanjem. pH vzorcev, obdelanih z encimi, je ves čas skladiščenja ostal med 4,05 in 4,31, medtem ko se je pH neobdelanega jabolčnega soka gibal med 4,12 in 4,33.
Skupna kislost (TA) tako neobdelanih kot z lakazo obdelanih vzorcev je pokazala trend zmanjševanja z naraščajočim časom skladiščenja (tabela 1). Zmanjšanje kislosti je bilo posledica pretvorbe organskih kislin v ogljikove hidrate ali encimskih reakcij, pa tudi oksidacije med shranjevanjem soka.⁶⁴Skupna kislost kontrolnega jabolčnega soka in vzorcev, obdelanih z encimi, je bila nižja kot pri drugih sokovih (jagodni sok 0,9 %, slivov sok 2,2 %, kumkvat sok 1,0 %, marelični sok 2,4 %, pomarančni sok 0,8 %), vendar podobna kot pri drugih sokovih (npr. hruškov sok 0,3 %).⁶²Te razlike v neobdelanem sveže stisnjenem jabolčnem soku so lahko posledica različnih dejavnikov, kot so rastni pogoji, genetski dejavniki, stopnja zrelosti in metode predelave.⁶⁵Zmanjšanje skupne kislosti kontrolnega in z lakazo obdelanega jabolčnega soka je skladno z rezultati, ki so jih predstavili Singh in sod.⁶⁶glede zmanjšanja skupne kislosti jabolčnega soka Jin Nuo po 74 dneh skladiščenja. Po drugi strani pa Oshmiansky in Wojdylo⁶⁷pri preučevanju učinka tradicionalnih metod čiščenja niso ugotovili bistvenih sprememb v kislosti jabolčnega soka.
Rezultati, predstavljeni v tabeli 1, kažejo, da je bila vrednost skupnih topnih trdnih snovi (TSS) v jabolčnem soku, obdelanem z lakazo, višja kot v neobdelanem vzorcu. Ti rezultati so skladni z objavljenimi študijami.⁶⁸Poleg tega tabela 1 kaže, da je bila vrednost skupne suhe snovi (TSS) kontrolne skupine z jabolčnim sokom na začetku 9,58 in je do konca obdobja skladiščenja dosegla 11,05. Te vrednosti so nižje od vrednosti TSS svežega jabolčnega soka, o katerih so poročali Hamid in sodelavci.⁶⁹(11,2 oziroma 11,80). Vrednost skupnih topnih snovi (TSS) vzorcev jabolčnega soka, obdelanega z lakazo, se je znatno povečala, začenši z 11,23 in dosegel 12,93 po dveh tednih shranjevanja pri 4 °C (tabela 1). Podobno povečanje TSS med shranjevanjem so opazili tudi pri agrumih, limonah in sladkih pomarančah. Povečanje skupnih topnih snovi (TSS) med shranjevanjem je lahko posledica hidrolize polisaharidov (škroba) v monosaharide (sladkorje), povečanja koncentracije zaradi dehidracije soka in razgradnje pektina v soku v topne trdne snovi. Povečanje skupnih topnih snovi (TSS) je verjetno posledica povečanja topnih sladkorjev, ki lahko nastanejo s pretvorbo pektina ali celuloze v topne sladkorje s pektinom oziroma celulazo ali s hidrolizo škroba v sladkorje, kot so poročali Hamed in sod.^69.Vpliv lakase na lastnosti jabolčnega soka je mogoče opazovati vizualno, saj ima jabolčni sok, obdelan z lakaso, boljšo tekočnost in nižjo viskoznost kot neobdelan sok. To opažanje je zabeleženo v tabeli 1; viskoznost vzorca, obdelanega z encimi, je bila 1,87 cP, medtem ko je bila viskoznost kontrolnega vzorca 2,95 cP. To znatno zmanjšanje viskoznosti je verjetno posledica večje sposobnosti zadrževanja vode pektinu podobnih snovi in ​​nastanka kohezivne mrežne strukture.
V tej študiji je bil raziskan vpliv lakaze na indeks porjavitve (BI) jabolčnega soka z merjenjem absorbance pri 420 nm s spektrofotometrom. Rezultati so prikazani v tabeli 1. Med shranjevanjem je BI vzorcev jabolčnega soka tako v tretirani kot v netretirani skupini pokazal postopno naraščajoč trend. BI odraža stopnjo porjavitve in lahko služi kot^pomembenindikator encimskih in neencimskih reakcij porjavitve. Absorbanca se je med shranjevanjem znatno povečala (P < 0,05). Ob koncu shranjevanja je bila_A420Vrednost vzorcev jabolčnega soka v kontrolni skupini in skupini, obdelani z encimi, se je povečala za približno 217 % oziroma 121 % (tabela 1). Rezultati kažejo, da lahko obdelava z encimi učinkovito zmanjša stopnjo porjavitve za približno 56 %. Rezultati Bezerre in sod.^[19]] so skladni z našimi rezultati; Za bistrenje jabolčnega soka so uporabili vlakna lakaze-glutaraldehida in kokosa, s čimer so zmanjšali njegovo prvotno barvo za 61 %.
Čeprav imajo polifenoli v sadnih sokovih pozitivne prehranske in terapevtske učinke na človeško telo, lahko reagirajo tudi z beljakovinami, kar povzroči motnost soka, sedimentacijo ali motnost, s čimer spremenijo okus in aromo izdelka ter skrajšajo njegov rok uporabnosti.⁷¹Cilj te študije je bil varno zmanjšati vsebnost fenolnih spojin v jabolčnem soku z uporabo lakaze iz Pleurotus ostreatus NRC 620. Rezultati, predstavljeni v tabeli 1, kažejo, da se je skupna vsebnost fenolnih spojin v jabolčnem soku, obdelanem z lakazo, pred shranjevanjem pri 4 °C znatno zmanjšala. Poleg tega se je skupna vsebnost fenolnih spojin v obeh preučevanih vzorcih zmanjšala tudi med shranjevanjem (tabela 1). Raziskava Sandrija in sodelavcev.⁷²je pokazala, da lahko encimsko obdelan jabolčni sok ohrani svojo antioksidativno aktivnost in vsebnost fenolnih spojin. Vendar pa so rezultati študije Lettera et al.⁷³kažejo, da lahko obdelava pomarančnega soka z glivično lakazo zmanjša vsebnost fenolnih spojin v njem za do 45 %.
Dokazano je, da imajo fenolne spojine lastnosti, kot so lovljenje prostih radikalov, redukcija in gašenje singletnega kisika, prenos atomov vodika in darovanje elektronov prostim radikalom, zaradi česar so močni antioksidanti.⁷⁴Zato so bile v tej študiji uporabljene metode na osnovi DPPH in FRAP za oceno vpliva lakaze na antioksidativno aktivnost jabolčnega soka, shranjenega v hladilniku 14 dni (tabela 2). Obe metodi sta pokazali povečanje antioksidativne aktivnosti med shranjevanjem, kar je lahko posledica povečanja prostih fenolnih spojin ali nastanka produktov Maillardove reakcije (MRP), pri čemer so produkti Maillardove reakcije verjetno vzrok za povečanje antioksidativne aktivnosti.⁷⁵Neencimske reakcije porjavitve (vključno z razgradnjo askorbinske kisline, Maillardovimi reakcijami in kislinsko katalizirano razgradnjo sladkorjev) proizvajajo rjave pigmente (melanoidine). Vmesni produkti razgradnje askorbinske kisline in produkti razgradnje sladkorjev (kot so karbonilne spojine) lahko reagirajo z aminokislinami preko Maillardovih reakcij.⁷⁶Čeprav je bilo porjavitev sadja in zelenjave med shranjevanjem obsežno preučevana, je naše razumevanje teh reakcij še vedno omejeno.⁷⁷V primerjavi z metodo FRAP je jabolčni sok, obdelan z lakazo, pokazal bistveno nižjo antioksidativno aktivnost z metodo DPPH (tabela 2), antioksidativna aktivnost vseh vzorcev pa se je s podaljšanjem časa shranjevanja znatno povečala. V tej študiji sta bili uporabljeni dve različni metodi za določanje antioksidativne aktivnosti, ker se njuna načela razlikujejo. Metoda DPPH meri sposobnost nevtralizacije prostih radikalov, medtem ko metoda FRAP meri sposobnost redukcije železovih ionov. Zato je priporočljivo uporabiti več metod za določanje antioksidativne aktivnosti, da bi bolje razumeli antioksidativno aktivnost preučevanih vzorcev.⁷⁸
Ena ključnih ugotovitev te študije je, da lakaza *Pleurotus ostreatus* NRC 620 kaže optimalno aktivnost pri 70 °C in pH 3,0. V primerjavi z drugimi glivičnimi lakazami, ki se pogosto uporabljajo za bistrenje soka, kot so lakaze *Trametes versicolor* in *Ganoderma lucidum*, ima *P. ostreatus* NRC 620 večjo toplotno stabilnost in bolj kisli pH. Lakaze iz *Trametes versicolor* in *Ganoderma lucidum* običajno kažejo optimalno aktivnost v območju 50–60 °C in pri pH vrednostih med 3,5 in 5,0. Ta razlika lahko prispeva k izboljšani učinkovitosti bistrenja soka, zlasti pri kislih sokovih, kjer je stabilnost pri nižjih vrednostih pH ključnega pomena. Edinstvena značilnost *P. V primerjavi z drugimi preučevanimi glivičnimi lakazami ima *Pleurotus ostreatus* NRC 620 sposobnost učinkovitega delovanja v zahtevnejših pogojih. Njegova višja optimalna temperatura aktivnosti kaže na potencialne prednosti v industrijskih aplikacijah, kot so hitrejše reakcije in manjša mikrobna kontaminacija. Njegov nizek pH, ki je zelo primeren za kislo naravo mnogih sokov, je lahko uporaben pri postopkih čiščenja sokov. Ti rezultati upravičujejo nadaljnje raziskave za uporabo v velikem obsegu, zaradi česar je *Pleurotus ostreatus* NRC 620 izvedljiva alternativa tradicionalnim virom glivičnih lakaz. V primerjavi s prejšnjimi študijami smo ugotovili, da je optimalna temperatura 60 °C, optimalni pH pa 3,0. Po 80 minutah reakcije pri 60 °C je lakaza *Ganoderma lucidum* ohranila⁴⁶% njegove aktivnosti.79 Po mnenju Kurniawatija in Nicelleja⁸⁰Encimi *Ganoderma lucidum* kažejo odlično do zmerno stabilnost pri 25 °C in pH vrednostih od 5,0 do 8,0 ter stabilnost pri pH 6,0 in temperaturah od 10 do 30 °C. V tej študiji smo ugotovili, da sta optimalna pH in temperatura za aktivnost encima pri *Pleurotus ostreatus* 3,0 oziroma 70 °C. Po dveh urah inkubacije pri 40 °C in 50 °C je encim ohranil 68,33 % oziroma 59,61 % svoje aktivnosti. Poleg tega je lakaza Pleurotus ostreatus NRC 620 pokazala visoko aktivnost v širokem temperaturnem območju od 50 °C do 80 °C, pri čemer je skoraj dosegla največjo aktivnost (69 %–98 %), največjo aktivnost pa je opazila pri 70 °C.
Skratka, lakaza NRC620 iz ostrigarskih gob, pridobljena v statičnih pogojih, je pokazala optimalno aktivnost in stabilnost v različnih pogojih pH in temperature, kar kaže na boljšo stabilnost v primerjavi z drugimi viri encimov. Dodatek 10 mM MgSO₄ in CuSO₄ je povečal aktivnost encima za približno 21 % oziroma 35 %. Pri predelavi v jabolčni sok je encim znižal pH in viskoznost, medtem ko se je vsebnost fenolov med shranjevanjem le nekoliko zmanjšala.
Rezultati potrjujejo potencial lakaze v živilski industriji, zlasti pri bistrenju pijač. Z namensko razgradnjo fenolnih spojin lakaza ne le zmanjša motnost in izboljša bistrost, temveč tudi ohranja kakovost sadnih sokov v blagih obratovalnih pogojih. Za razliko od tradicionalnih bistrilnih sredstev, kot so želatina, bentonit in silikagel, lakaza ne ustvarja odpadkov ali odstranjuje prijetnih arom iz pijač, zaradi česar je okolju prijaznejša in trajnostna možnost. Poleg tega lakaza v primerjavi z drugimi encimi in metodami filtracije ponuja ciljno usmerjeno in stroškovno učinkovito rešitev brez ogrožanja kakovosti izdelka.
Kyomuhimbo, HD in Brink, HG. Uporaba in strategije imobilizacije lakaz, ki vsebujejo baker; pregled. Heliyon 9, e13156 (2023).